6.La transformación bioquímica y microbiológica de la leche en yogur y el yogur con probióticos

En esta instancia es necesario definir los términos “yogur” y “probióticos”. El Código Alimentario Argentino define al yogur como el producto obtenido de la fermentación de la leche con cultivos lácticos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus (llamados fermentos) a los que en forma complementaria pueden acompañar otras bacterias (probióticos, por ejemplo). El hecho de que el yogur se encuentre descripto en el código alimentario es un indicador de su seguridad para el consumo en todas las etapas de la vida.

En relación al térmico “probióticos”, la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO, por sus siglas en inglés) adoptaron una definición que indica que los probióticos son microorganismos vivos que, cuando son administrados en cantidades adecuadas, producen un efecto benéfico sobre el hospedador. Esta definición ha tenido aceptación a nivel científico global. En Argentina, el Instituto de Nacional de Alimentos (INAL), dependiente del ANMAT, incorporó esta definición en el Código Alimentario Argentino para regular el rotulado de alimentos que incluyen probióticos, como lo son algunos yogures y algunas fórmulas infantiles que han incorporado probióticos. Con el término de probióticos nos vamos a referir a los grupos microbianos más utilizados para este fin en alimentos, los lactobacilos y las bifidobacterias. En suplementos dietarios podemos encontrar además otros grupos como ciertas levaduras (Saccharomyces boulardii, por ejemplo) y bacilos esporulados (Bacillus claussi, Bacillus coagulans, por ejemplo). Entre los lactobacilos y las bifidobacterias, las especies más comunes dentro de las cuales encontramos cepas probióticas son Lactobacillus casei, Lactobacillus, rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, etc. Los probióticos no son todos iguales, cada cepa tiene sus beneficios demostrados. Las cepas son un cultivo particular dentro de una especie, que se identifica con un código de letras y/o números seguido al nombre de la especie. Hay cepas con efectos sobre la inmunidad del intestino, otras capaces de inhibir patógenos y otras con actividades antiinflamatorias, y muchas a la vez comparten parcialmente algunas de estas propiedades. En este sentido, en el mercado existen cepas particulares de probióticos como Lactobacillus rhamnosus GG, L. casei DN-114001, L. rhamnosus CRL1505, L. plantarum 229v, L. casei Shirota, L. paracasei CRL 431, L. acidophilus LA5, L. acidophilus NCFM, B. animalis subsp. lactis BB12, B. animalis subsp. lactis DN173010, B. animalis subsp. lactis HN019, B. longum BB536, L. reuteri SD2112, L. reuteri DSM 17938, entre otras (Tripathi y Giri, 2014).

De aquí en adelante denominaremos bacterias del fermento, cultivos lácticos o cultivos iniciadores, a las bacterias empleadas para la fermentación de la leche y la fabricación del yogur (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus), mientras que, con el término probióticos, nos referiremos a cepas específicas de Lactobacillus y Bifidobacterium.

Como consumidores, y con un poco de atención, podemos distinguirse dos tipos de yogures en las góndolas de los supermercados: aquellos denominados “firmes”, los cuales se reconocen por estar disponibles en potes y presentar una alta viscosidad –lo que hace que se deban comer con la ayuda de una cuchara– en contraposición con aquellos denominados “bebibles” y “líquidos”, que se pueden beber directamente de la botella, por ser más fluidos, es decir, más o menos líquidos según la formulación y el proceso tecnológico que le sigue a la fermentación. Los yogures popularmente conocidos como “griegos”, no tienen una atención particular dentro del Código Alimentario Argentino, sino que se trata de una variedad con mayor viscosidad o densidad de nutrientes, que se logra por el aumento de las proteínas, las grasas, de ambas y a su vez por la eliminación parcial del suero, lo cual se puede hacer también en casa mediante el filtrado del yogur casero mediante una tela limpia. La eliminación del suero se lleva consigo parte de la lactosa remanente de la fermentación, lo que lo hace más apropiado para personas con diferente grado de intolerancia a la lactosa.

Para la elaboración de un yogur es necesario partir de una leche de buena calidad; esto significa una carga microbiana total moderada (la cual será reducida a niveles inocuos mediante un tratamiento térmico) y la ausencia de antibióticos, que podrían provenir de la producción primaria de la leche. El hecho de que las bacterias del fermento puedan crecer en la leche para transformarla en yogur es la mejor garantía de la ausencia de antibióticos en el producto, ya que la presencia de los mismos impediría la fermentación, al inhibir a las bacterias del fermento. La leche de buena calidad es entonces parcial o totalmente descremada, adicionada con sólidos lácteos (leche descremada en polvo, por ejemplo), para elevar el contenido de sólidos totales hasta 10-15% (p/v), y, según el caso, azúcares, edulcorantes y colorantes, seguido de un tratamiento térmico para la inactivación de microorganismos patógenos y deteriorantes. Llegado este punto, la leche será inoculada en condiciones de extrema asepsia con las bacterias del fermento y, si se tratara de un yogur firme, con los probióticos, ya que en este tipo de yogures la fermentación de la leche tendrá lugar dentro del mismo contenedor o pote que llegará al consumidor, y no dentro de un tanque fermentador. En el caso de los yogures batidos o bebibles, la fermentación se lleva a cabo en grandes fermentadores de acero inoxidable, y el producto coagulado resultante sufre un proceso de quiebre de la cuajada y fluidificación mediante el paso por bombas especializadas, que –dependiendo de la intensidad de este tratamiento– conducirá a la obtención de un producto más o menos bebible (agitación suave o vigorosa). Los probióticos pueden ser entonces agregados en esta instancia, una vez que el producto ha sido parcialmente enfriado. Cabe aclarar que la fermentación de la leche, es decir la acidificación desde el pH natural de la misma (cercano a 6,4) hasta el pH final del producto, cercano a pH 4,5, es una tarea llevada a cabo por las bacterias del fermento, cuando la leche se calienta y se mantiene a 42-43°C. Los microorganismos S. thermophilus y L. delbrueckii subsp. bulgaricus establecen entré sí un fenómeno de mutua cooperación, denominado específicamente protocoperación. Esta sinergia hace que ambas especies crezcan en leche a mayor velocidad que si lo hicieran por separado, debido a que una especie produce metabolitos que son aprovechados por la otra, y viceversa. Esto permite reducir el pH de la leche en un período generalmente menor a las 5-6 h y aumentar entre 100 y 1.000 veces la concentración de los cultivos lácticos iniciadores. Si los probióticos están presentes durante el proceso fermentativo, poco pueden aportar al mismo y acidificar y crecer en el producto, por lo que deben ser agregados a la leche en los niveles de células viables que se pretenden estén en el producto final. Durante la fermentación láctica de la leche, las bacterias del fermento pueden llegar a niveles de células viables de 1×108-9 UFC/mL, mientras que los probióticos serán adicionados a niveles de 1×107 UFC/mL, pudiendo alcanzar concentraciones de un orden logarítmico más (1×108 UFC/mL), solo en el caso de que sean capaces de crecer durante la fermentación. Son en estos niveles de células viables en los que deben encontrarse tanto las bacterias del fermento como los probióticos, para que un yogur con probióticos ejerza su efecto benéfico sobre la salud. Dos ejemplos de yogures con probióticos cuyos alegatos de salud han sido evaluados y autorizados por la ANMAT son los que contienen las cepas L. casei DN-114001 ó L. rhamnosus CRL1505, cuyos benéficos efectos demostrados tienen que ver, respectivamente, con la activación del sistema inmunológico o “aumento de las defensas” (Poon y col., 2020) o prevención de infecciones gastrointestinales y respiratorias en niños (Villena y col., 2012).

En relación a la lactosa, la leche tiene un contenido natural de este azúcar del 4,5-5%. Cuando la leche se acondiciona para su fermentación, es decir, se agregan los sólidos lácteos necesarios, el contenido de lactosa disminuye a cerca del 4% (por la dilución natural al ser adicionada la leche de otros ingredientes). La fermentación microbiana para transformar la leche en yogur hace que se consuma de un 25 a un 30% de la lactosa presente, por lo que podemos decir que el contenido de lactosa en yogur es inferior al de la leche. Adicionalmente, la lactosa será desdoblada, o digerida, en su paso por el tracto intestinal debido a la acción de la enzima lactasa bacteriana de las bacterias del fermento. Un yogur se digiere mucho más fácilmente que el equivalente en leche. A su vez es también posible la elaboración de yogur con leche deslactosada.

Numerosos metabolitos microbianos, no presentes en la leche antes de la fermentación, aparecen en el yogur como resultado de la acción fermentativa de las bacterias lácticas del fermento. Estos productos son el ácido láctico y otros ácidos orgánicos, los péptidos derivados de la acción hidrolítica de las bacterias lácticas, principalmente sobre la principal proteína de la leche, la caseína (Korhonen, 2009), los exopolisacáridos o cadenas poliméricas de azúcares con efectos tecnológicos espesantes y funcionales sobre la salud (Harutoshi, 2013), compuestos antimicrobianos de diferente naturaleza (peróxido de hidrógeno, compuestos tipo bacteriocinas) que, junto al ácido láctico, contribuyen a la estabilidad y seguridad microbiológica del yogur, e incluso galactooligosacáridos, con propiedades prebióticas, provenientes de reacciones bioquímicas de la lactosa durante la fermentación (Martínez-Villauenga y col., 2008). Todos estos componentes no microbianos contribuyen a la acción benéfica de los probióticos en yogures.

Una preocupación recurrente entre los consumidores de yogur es lo que podría suceder cuando este alimento sufre una interrupción temporal de la cadena de frío, como puede ser el período transcurrido entre el hogar y el momento de su consumo en la escuela, la oficina o el gimnasio después de una sesión de entrenamiento, el momento en que es descargado del camión refrigerado de reparto y su colocación en góndola o el período entre la góndola del supermercado y la heladera de casa. En este sentido podríamos pensar en lo que sucedería las bacterias lácticas y los probióticos presentes, o, en un escenario hipotético, los microorganismos potencialmente patógenos teóricamente presentes. Podríamos pensar por otro lado lo que podría ocurrir desde el punto de vista de las propiedades fisicoquímicas (pH, acidez, separación del suero) y sensoriales (gusto, sabor) del producto. La transformación bioquímica de la leche en yogur, principalmente la generación de ácido láctico que lleva al pH del yogur a un valor cercano o menor a 4,5 es la principal responsable de la seguridad microbiológia del producto en relación a la posible proliferación de patógenos alimentarios. En trabajos de laboratorio donde se agregan ex profeso patógenos a la leche para estudiar el destino de una posible contaminación cruzada, se ha reportado que patógenos alimentarios como Salmonella y Shigella son rápidamente inactivados en yogur (Alm, 1983), lo mismo ocurre para Escherichia coli y Listeria monocytogenes (Ahmed y col., 2014) y Brucella (Falenski y col., 2011). Incluso la inactivación de E. coli en yogures es más rápida a temperatura ambiente que a temperatura de refrigeración (Bachrouri y col. 2016). No obstante, el yogur en la industria se elabora con leche que es sometida dos veces a tratamientos térmicos que aseguran la eliminación de los posibles microorganismos patógenos que pudieran venir del tambo. Es altamente improbable que un patógeno sobreviva y pase al yogur. En este contexto, si el producto se ha mantenido adecuadamente cerrado, y pierde la cadena de frío, es muy poco probable la proliferación de patógenos, los cuales ya habrían sido inactivados en las etapas previas (doble pasteurización, fermentación). En relación a la sobrevida de las bacterias lácticas del cultivo iniciador y los probióticos presentes, existen algunos estudios que abordaron esta temática. Scharl y col. (2011) reportaron una reducción de entre el 10 y el 50% del número de células viables en yogures con probióticos conservados a temperatura ambiente por 24 h. Si consideramos que el recuento bacteriano de las cepas presentes puede estar en 2-3×108 UFC/mL, una reducción del 50% implica un recuento de células viables de aproximadamente 1-1,5×108 UFC/mL, lo que no hace cambiar la magnitud, en órdenes logarítmicos, del recuento de células viables. Muhammad y col. (2009), reportaron un aumento en el nivel de células viables de los cultivos lácticos en yogures conservados a 21°C por 7 días, respecto a los productos mantenidos en heladera, esto significa que las bacterias lácticas retomaron su crecimiento una vez colocado el producto fuera de la heladera. Ferdousi y col. (2013) observaron pérdidas en los niveles de células viables de L. rhamnosus, L. paracasei, L. acidophilus, y Bifidobacerium lactis de menos de 0,5 órdenes logarítmicos en yogures mantenidos a 20°C durante 24 hs. Sin embargo, el almacenamiento a mayores temperaturas que la refrigeración, pueden producir una menor aceptabilidad y rechazo por parte del consumidor por la separación del suero (aparece una capa acuosa sobre la masa del yogur) y la sobreacidificación (mayor acidez) por el mayor metabolismo de las bacterias lácticas (Mudawi y col., 2014). En este sentido, el hecho de mantener un yogur a temperatura ambiente durante algunas horas, puede suponer el rechazo sensorial por parte del consumidor por presentar separación de suero o una mayor acidez, siendo prácticamente despreciable el efecto sobre la sobrevida de las bacterias lácticas del starter o los probióticos, sin haberse reportado la capacidad de proliferar de patógenos hipotéticamente presentes.

Vale la pena comparar lo que sucede con otros alimentos fermentados que se mantienen durante mucho más tiempo a temperatura ambiente, sin esto ser percibido como riesgoso por parte de los consumidores (lo cual no lo es, porque es parte de lanaturaleza de los alimentos fermentados). El yogur en la industria se produce en 5-6 horas y se refrigerada para detener la acción fermentativa de las bacterias lácticas y que no se sobreacidifique. Cuando hacemos yogur en casa, a menos que utilicemos una yogurtera, al elaborarlo en una olla cubierta o en un termo, el tiempo de fermentación y la exposición a la temperatura ambiente suele ser superior (de 10 a 16hs). El kéfir de leche se suele mantener a temperatura ambiente por 24 h, el de agua de 48 a 72h, la kombucha hasta 10 días, el chucrut en 10 y 14 días. Mantener un alimento fermentado a temperatura ambiente puede comprometer sus propiedades sensoriales (aparición de sabores ácidos, amargos), pero muy difícilmente puede suponer un riesgo microbiológico si ha sido preparado en condiciones higiénicas.

La fermentación de la leche por parte de S. thermophilus y L. delbrueckii subsp. bulgaricus para su conversión en yogur implica una profunda transformación microbiológica y bioquímica de la misma, donde una leche de alta calidad, libre de antibióticos es desprovista de microorganismos patógenos o alterantes por un tratamiento térmico, seguido de la inoculación de las cepas del fermento iniciador para que tengan lugar cambios bioquímicos únicos, mientras el producto se enriquece en microorganismos viables, sean tanto los del cultivo iniciador en multiplicación o como de cultivos probióticos adicionados. Los principales cambios bioquímicos implican una drástica disminución de la lactosa por hidrólisis microbiana, y una sucesiva hidrólisis durante el tránsito gastrointestinal debido a la lactasa de los cultivos iniciadores que será liberada en el intestino por la digestión gastrointestinal de los mismos. Otros cambios bioquímicos implican la hidrólisis parcial de la caseína por acción de las proteasas microbianas ancladas en su pared celular, con la consecuente liberación al medio lácteo de múltiples fragmentos peptídicos con potencial bioactivo, la síntesis de exopolisacaridos con valor tecnológico (contribuyen a la viscosidad del producto) y potencial funcional para la salud, producción de ácido láctico y otros ácidos orgánicos que acidifican y coagulan el producto y le confieren estabilidad y seguridad microbiológica (inhibición de posibles patógenos contaminantes), la producción de otros compuestos antimicrobianos, como el peróxido de hidrógeno y compuestos tipo bacteriocinas, y la aparición en el medio de compuestos con acción prebiótica como los galactooligosacáridos.